Käärmeen myrkky sisältää entsyymejä, jotka hydrolysoivat karboksyyliesterisidoksia.Hydrolyysin substraatit ovat fosfolipidit, asetyylikoliini ja aromaattinen asetaatti.Näitä entsyymejä on kolmenlaisia: fosfolipaasi, asetyylikoliiniesteraasi ja aromaattinen esteraasi.Käärmeen myrkkyssä oleva arginiiniesteraasi voi myös hydrolysoida synteettistä arginiinia tai lysiiniä, mutta pääasiassa se hydrolysoi proteiinien peptidisidoksia luonnossa, joten se kuuluu proteaaseihin.Tässä käsitellyt entsyymit vaikuttavat vain esterisubstraatteihin eivätkä ne voi vaikuttaa mihinkään peptidisidokseen.Näistä entsyymeistä asetyylikoliiniesteraasin ja fosfolipaasin biologiset toiminnot ovat tärkeämpiä ja niitä on tutkittu täysin.Joillakin käärmeen myrkkyillä on voimakas aromaattinen esteraasiaktiivisuus, joka voi hydrolysoida p-nitrofenyylietyyliesteriä, a- tai P-naftaleeniasetaattia ja indolietyyliesteriä.Vielä ei tiedetä, tuottaako tämä aktiivisuus riippumattoman entsyymin vai karboksyyliesteraasin tunnetun sivuvaikutuksen vaikutuksesta, puhumattakaan sen biologisesta merkityksestä.Kun Agkistrodon halys Japonicuksen myrkky saatettiin reagoimaan p-nitrofenyylietyyliesterin ja indolietyyliesterin kanssa, p-nitrofenolin ja indolifenolin hydrolysaatteja ei löytynyt;Päinvastoin, jos nämä esterit reagoivat kobra Zhoushan -alalajin käärmemyrkyn ja Bungarus multicinctus -käärmemyrkyn kanssa, ne hydrolysoituvat nopeasti.Tiedetään, että näillä kobramyrkkyillä on voimakas koliiniesteraasiaktiivisuus, mikä saattaa olla vastuussa edellä mainittujen substraattien hydrolyysistä.Itse asiassa Mclean et ai.(1971) raportoivat, että monet Cobra-perheeseen kuuluvat käärmemyrkyt voivat hydrolysoida indolietyyliesteriä, naftaleenietyyliesteriä ja butyylinaftaleeniesteriä.Nämä käärmeen myrkyt tulevat: kobrasta, mustakaulakobrasta, mustahuulikobrasta, kultakobrasta, egyptiläisestä kobrasta, kuningaskobrasta, kultakobramambasta, mustamambasta ja valkohuulimambasta (D. aw tuntee edelleen itämaisen rombola-kalkkarokäärmeen
Käärmeen myrkky voi hydrolysoida metyyli-indolietyyliesteriä, joka on substraatti seerumin koliiniesteraasiaktiivisuuden määrittämiselle, mutta tämä käärmeen myrkky ei osoita koliiniesteraasiaktiivisuutta.Tämä osoittaa, että kobramyrkkyssä on tuntematon esteraasi, joka eroaa koliiniesteraasista.Tämän entsyymin luonteen ymmärtämiseksi tarvitaan lisätyötä.
1, fosfolipaasi A2
(I) Yleiskatsaus
Fosfolipaasi on entsyymi, joka voi hydrolysoida glyseryylifosfaattia.Luonnossa on 5 erilaista fosfolipaasi, nimittäin fosfolipaasi A2 ja fosfolipaasi
A. , fosfolipaasi B, fosfolipaasi C ja fosfolipaasi D. Käärmeen myrkky sisältää pääasiassa fosfolipaasi A2:ta (PLA2), muutama käärmeen myrkky sisältää fosfolipaasi B:tä ja muita fosfolipaasi on pääasiassa eläinkudoksissa ja bakteereissa.Kuviot 3-11-4 esittävät näiden fosfolipaasien vaikutuskohdan substraattihydrolyysissä.
Fosfolipaaseista PLA2:ta on tutkittu enemmän.Se saattaa olla tutkituin entsyymi käärmeen myrkyssä.Sen substraatti on esterisidos Sn-3-glyserofosfaatin toisessa asemassa.Tätä entsyymiä löytyy laajalti käärmemyrkystä, mehiläismyrkystä, skorpionimyrkystä ja eläinkudoksesta, ja PLA2:ta on runsaasti neljässä perheen käärmemyrkkyssä.Koska tämä entsyymi hajottaa punasoluja ja aiheuttaa hemolyysiä, sitä kutsutaan myös "hemolysiiniksi".Jotkut ihmiset kutsuvat myös PLA2-hemolyyttistä lesitinaasia.
Ludeeke havaitsi ensin, että käärmeen myrkky voi tuottaa hemolyyttistä yhdistettä vaikuttamalla lesitiiniin entsyymien kautta.Myöhemmin Delezenne et ai.todistettiin, että kun kobran myrkky vaikuttaa hevosen seerumiin tai keltuaiseen, se muodostaa hemolyyttisen aineen.Nyt tiedetään, että PLA2 voi vaikuttaa suoraan erytrosyyttikalvon fosfolipideihin tuhoten punasolukalvon rakenteen ja aiheuttaen suoran hemolyysin;Se voi myös vaikuttaa seerumiin tai lisättyyn lesitiiniin tuottaen hemolyyttistä lesitiiniä, joka vaikuttaa punasoluihin ja tuottaa epäsuoraa hemolyysiä.Vaikka PLA2:ta on runsaasti neljässä käärmemyrkkyperheessä, eri käärmemyrkkyjen entsyymipitoisuus on hieman erilainen.Rattlesnake (C
Käärmeen myrkky osoitti vain heikkoa PLA2-aktiivisuutta.Taulukko 3-11-11 havainnollistaa PLA2-aktiivisuuden vertailua 10 suurimman myrkyllisen käärmeen myrkkyssä Kiinassa.
Taulukko 3-11-11 10 käärmemyrkyn fosfolipaasi VIII -aktiivisuuden vertailu Kiinassa
Käärmeen myrkky
Rasvan vapautuminen
Alifaattinen happo,
Cjumol/mg)
Hemolyyttinen aktiivisuus CHU50/^ g * ml)
Käärmeen myrkky
Vapauta rasvahappoja
(^raol/mg)
Hemolyyttinen aktiivisuus "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
yksitoista
Micracephal ophis
viisi piste yksi nolla
kalyspallas
8. 68
kaksituhatta kahdeksansataa
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
kolme pistettä kahdeksan kaksi
sata neljäkymmentä
Bnugarus fasctatus
7,56
kaksisataa kahdeksankymmentä
B. multicinctus
yksi piste yhdeksän kuusi
kaksisataa kahdeksankymmentä
Viper ja russelli
seitsemän pistettä nolla kolme
T, mucrosquamatus
yksi piste kahdeksan viisi
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Erotus ja puhdistus
PLA2-pitoisuus käärmeen myrkkyssä on suuri, ja se kestää lämpöä, happoa, alkalia ja denaturoivaa ainetta, joten se on helppo puhdistaa ja erottaa PLA2.Yleinen menetelmä on ensin suorittaa geelisuodatus raakamyrkkylle, sitten suorittaa ioninvaihtokromatografia, ja seuraava vaihe voidaan toistaa.On huomattava, että PLA2:n pakastekuivaus ioninvaihtokromatografian jälkeen ei saa aiheuttaa aggregaatiota, koska kylmäkuivausprosessi lisää usein järjestelmän ionivahvuutta, mikä on tärkeä PLA2:n aggregoitumista aiheuttava tekijä.Yllä olevien yleisten menetelmien lisäksi on otettu käyttöön myös seuraavat menetelmät: ① Wells et ai.② PLA2:n substraattianalogia käytettiin ligandina affiniteettikromatografiassa.Tämä ligandi voi sitoutua PLA2:een käärmemyrkkyssä Ca2+:n kanssa.EDTA:ta käytetään useimmiten eluenttina.Kun Ca2+ on poistettu, affiniteetti PLA2:n ja ligandin välillä vähenee ja se voidaan erottaa ligandista.Toiset käyttävät 30 % orgaanista liuosta tai 6 mol/l ureaa eluenttina.③ Hydrofobinen kromatografia suoritettiin PheiiylSephar0SeCL-4B:llä PLA2-jäämien poistamiseksi kardiotoksiinista.④ Anti-PLA2-vasta-ainetta käytettiin ligandina suorittamaan affiniteettikromatografia PLA2:lle.
Tähän mennessä suuri määrä käärmemyrkkyä PLAZ on puhdistettu.Tu et ai.(1977) listasivat PLA2:n, joka oli puhdistettu käärmeen myrkystä ennen vuotta 1975. Viime vuosina on raportoitu joka vuosi suuri määrä artikkeleita PLA2:n erottamisesta ja puhdistamisesta.Tässä keskitymme kiinalaisten tutkijoiden PLA:n erottamiseen ja puhdistamiseen.
Chen Yuancong et ai.(1981) erottivat kolme PLA2-lajia Agkistrodon halys Pallasin myrkystä Zhejiangissa, jotka voidaan jakaa happamaan, neutraaliin ja emäksiseen PLA2:een isoelektristen pisteidensä mukaan.Myrkyllisyytensä mukaan neutraali PLA2 on myrkyllisempää, mikä on tunnistettu presynaptiseksi neurotoksiiniksi Agkistrodotoksiiniksi.Alkalinen PLA2 on vähemmän myrkyllinen, ja happamalla PLA2:lla ei ole lähes mitään myrkyllisyyttä.Wu Xiangfu et ai.(1984) vertasivat kolmen PLA2:n ominaisuuksia, mukaan lukien molekyylipaino, aminohappokoostumus, N-pää, isoelektrinen piste, lämpöstabiilisuus, entsyymiaktiivisuus, toksisuus ja hemolyyttinen aktiivisuus.Tulokset osoittivat, että niillä oli samanlainen molekyylipaino ja lämpöstabiilius, mutta niillä oli merkittäviä eroja muista näkökohdista.Entsyymiaktiivisuuden näkökulmasta hapan entsyymiaktiivisuus oli korkeampi kuin alkalinen entsyymiaktiivisuus;Emäksisen entsyymin hemolyyttinen vaikutus rotan punasoluihin oli voimakkain, jota seurasi neutraali entsyymi ja hapan entsyymi tuskin hemolysoitunut.Siksi spekuloidaan, että PLAZ:n hemolyyttinen vaikutus liittyy PLA2-molekyylin varaukseen.Zhang Jingkang et ai.(1981) ovat valmistaneet Agkistrodotoksiinikiteitä.Tu Guangliang et ai.(1983) raportoivat, että myrkyllinen PLA, jonka isoelektrinen piste oli 7,6, eristettiin ja puhdistettiin Vipera rotunduksen myrkystä Fujianista ja sen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista, aminohappokoostumuksesta ja 22 aminohappotähteen sekvenssistä N:ssä -pääte päätettiin.Li Yuesheng et ai.(1985) eristi ja puhdisti toisen PLA2:n Viper rotunduksen myrkystä Fujianissa.PLA2*:n alayksikkö on 13 800, isoelektrinen piste 10,4 ja spesifinen aktiivisuus 35/xnioI/miri mg. Kun lesitiini on substraatti, entsyymin optimaalinen pH on 8,0 ja optimaalinen lämpötila 65 °C. LD5 injektoituna suonensisäisesti hiiriin.Se on 0,5 ± 0,12 mg/kg.Tällä entsyymillä on ilmeisiä antikoagulantteja ja hemolyyttisiä vaikutuksia.Myrkyllinen PLA2-molekyyli koostuu 123 tähteestä 18 erilaista aminohappoa.Molekyyli sisältää runsaasti kysteiiniä (14), asparagiinihappoa (14) ja glysiiniä (12), mutta sisältää vain yhden metioniinin ja sen N-pää on seriinitähde.Verrattuna Tuguangin eristämään PLA2:een näiden kahden isoentsyymin molekyylipaino ja aminohappotähteiden lukumäärä ovat hyvin samankaltaisia, ja myös aminohappokoostumus on hyvin samanlainen, mutta asparagiinihappo- ja proliinitähteiden määrä on hieman erilainen.Guangxin kuningaskobra-käärmemyrkky sisältää runsaasti PLA2:ta.Shu Yuyan et ai.(1989) eristi myrkystä PLA2:n, jonka spesifinen aktiivisuus on 3,6 kertaa suurempi kuin alkuperäisellä myrkkyllä, molekyylipaino 13 000, koostumus 122 aminohappotähteellä, isoelektrinen piste 8,9 ja hyvä lämpöstabiilisuus.Elektronimikroskoopilla tehdystä havainnosta emäksisen PLA2:n vaikutuksesta punasoluihin voidaan nähdä, että sillä on ilmeinen vaikutus ihmisen punasolukalvoon, mutta sillä ei ole selvää vaikutusta vuohen punasoluihin.Tällä PLA2:lla on ilmeinen hidastusvaikutus punasolujen elektroforeettiseen nopeuteen ihmisissä, vuohissa, kaneissa ja marsuissa.Chen et ai.Tämä entsyymi voi estää ADP:n, kollageenin ja natriumarakidonihapon indusoimaa verihiutaleiden aggregaatiota.Kun PLA2-konsentraatio on 10/xg/ml~10 kannu/ml, verihiutaleiden aggregaatio estyy täysin.Jos materiaaleina käytettiin pestyjä verihiutaleita, PLA2 ei voinut estää aggregaatiota pitoisuudella 20 Mg/ml.Aspiriini on syklo-oksigenaasin estäjä, joka voi estää PLA2:n vaikutusta verihiutaleisiin.PLA2 voi estää verihiutaleiden aggregaatiota hydrolysoimalla arakidonihappoa tromboksaani A2:n syntetisoimiseksi.Zhejiangin maakunnassa Agkistrodon halys Pallas -myrkyn tuottaman PLA2:n liuoskonformaatiota tutkittiin ympyrädikroismin, fluoresenssin ja UV-absorption avulla.Kokeelliset tulokset osoittivat, että tämän entsyymin pääketjun konformaatio oli samanlainen kuin samantyyppisen muiden lajien ja sukujen entsyymin, luuston konformaatiolla oli hyvä lämmönkestävyys ja happaman ympäristön rakennemuutos oli palautuva.Aktivaattorin Ca2+ ja entsyymin yhdistelmä ei vaikuta tryptofaanitähteiden ympäristöön, kun taas inhibiittori Zn2+ toimii päinvastoin.Tapa, jolla liuoksen pH-arvo vaikuttaa entsyymiaktiivisuuteen, eroaa yllä olevista reagensseista.
Käärmeen myrkyn PLA2-puhdistusprosessissa ilmeinen ilmiö on, että käärmeen myrkky sisältää kaksi tai useampia PLA2-eluointihuippuja.Tämä ilmiö voidaan selittää seuraavasti: ① johtuu isotsyymien olemassaolosta;② Eräänlainen PLA2 polymeroidaan useiksi PLA2-seoksiksi, joilla on eri molekyylipainot, joista useimmat ovat välillä 9 000 - 40 000;③ PLA2:n ja muiden käärmeen myrkkykomponenttien yhdistelmä monimutkaistaa PLA2:ta;④ Koska PLA2:n amidisidos hydrolysoituu, varaus muuttuu.① ja ② ovat yleisiä, lukuun ottamatta vain muutamia poikkeuksia, kuten PLA2 CrWa/w käärmemyrkkyssä
On kaksi tilannetta: ① ja ②.Kolmas tila on löydetty PLA2:sta seuraavien käärmeiden myrkyssä: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestiinalainen kyy, hiekkakyy ja kauheat kalkkarokäärme km.
Tapauksen ④ tulos saa PLA2:n migraationopeuden muuttumaan elektroforeesin aikana, mutta aminohappokoostumus ei muutu.Peptidit voidaan hajottaa hydrolyysillä, mutta yleensä ne ovat edelleen sitoutuneet toisiinsa disulfidisidoksilla.Itäisen kuopan kalkkarokäärmeen myrkky sisältää kahta PLA2-muotoa, joita kutsutaan tyypin a ja tyypin p PLA2:ksi.Ero näiden kahden PLA2-tyypin välillä on vain yksi aminohappo, eli yhden PLA2-molekyylin glutamiini korvataan glutamiinihapolla toisessa PLA2-molekyylissä.Vaikka tämän eron tarkka syy ei ole selvä, sen uskotaan yleensä liittyvän PLA2:n deaminaatioon.Jos Palestiinan kyykäärmeen PLA2 pidetään lämpimänä raa'an myrkyn kanssa, sen entsyymimolekyylien päätyryhmiä tulee enemmän kuin ennen.C:sta käärmeen myrkystä eristetyllä PLA2:lla on kaksi erilaista N-päätettä ja sen molekyylipaino on 30 000. Tämä ilmiö voi johtua PLA2:n epäsymmetrisestä dimeeristä, joka on samanlainen kuin PLA2:n muodostama symmetrinen dimeeri itäisen timanttiselkäkäärmeen myrkkyssä. ja läntinen vinoneliö kalkkarokäärme.Aasialainen kobra koostuu useista alalajeista, joista jotkin eivät ole kovin tarkkoja luokittelussa.Esimerkiksi se, mitä aiemmin kutsuttiin Cobra Outer Kaspian alalajiksi, on nyt tunnistettu
Se pitäisi lukea ulkoisen Kaspianmeren kobrasta.Koska alalajeja on monia ja ne sekoittuvat keskenään, käärmeen myrkyn koostumus vaihtelee suuresti eri lähteistä johtuen, ja myös PLA2-isotsyymien pitoisuus on korkea.Esimerkiksi kobramyrkky
Ainakin 9 erilaista PLA2-isotsyymiä r^ll-lajeista löydettiin ja 7 erilaista PLA2-isotsyymejä löydettiin kobra-alalajin Kaspian myrkystä.Durkin et ai.(1981) tutkivat PLA2-pitoisuutta ja isotsyymien määrää eri käärmemyrkkyissä, mukaan lukien 18 kobramyrkkyä, 3 mambamyrkkyä, 5 kyykäärmeen myrkkyä, 16 kalkkarokäärmeen myrkkyä ja 3 merikäärmeen myrkkyä.Yleensä kobramyrkyn PLA2-aktiivisuus on korkea, ja siinä on monia isotsyymejä.Kyykäärmeen PLA2-aktiivisuus ja isotsyymit ovat keskitasoa.Mamba- ja kalkkarokäärmemyrkkyjen PLA2-aktiivisuus on erittäin alhainen tai ei ollenkaan PLA2-aktiivisuutta.Myös merikäärmeen myrkyn PLA2-aktiivisuus on alhainen.
Viime vuosina ei ole raportoitu, että käärmeen myrkkyssä oleva PLA2 olisi olemassa aktiivisen dimeerin muodossa, kuten itäisen romboforan kalkkarokäärme (C. käärmemyrkky sisältää tyypin a ja tyypin P PLA2, jotka molemmat koostuvat kahdesta identtisestä alayksiköstä , ja vain dimeraasilla on
Toiminta.Shen et ai.ehdotti myös, että vain käärmeen myrkyn PLA2:n dimeeri on entsyymin aktiivinen muoto.Tilarakenteen tutkimus osoittaa myös, että läntisen timanttiselkäkäärmeen PLA2 on olemassa dimeerin muodossa.Kalaa syövä yhdiste
Käärmeen myrkkyä on kaksi erilaista PLA ^ Ei ja E2, joissa 仏 esiintyy dimeerin muodossa, dimeeri on aktiivinen ja sen dissosioitunut monomeeri on inaktiivinen.Lu Yinghua et ai.(1980) tutkivat edelleen E. Jayanthin et ai.(1989) eristivät emäksisen PLA2:n (VRVPL-V) kyynmyrkystä.Monomeerin PLA2 molekyylipaino on 10 000, jolla on tappavia, antikoagulantti- ja turvotusvaikutuksia.Entsyymi voi polymeroida eri molekyylipainoisia polymeerejä PH 4,8:n olosuhteissa, ja polymeerien polymeroitumisaste ja molekyylipaino kasvavat lämpötilan noustessa.96 °C:ssa syntyneen polymeerin molekyylipaino on 53 100, ja tämän polymeerin PLA2-aktiivisuus kasvaa kahdella
Postitusaika: 18.11.2022